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Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit 

● 货品内容：

● 产品简介：

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中非变性分离蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。

本产品包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在 60 kD-1000 kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。

● 运输和贮存：

本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。

● 使用说明：

1. 样品制备：

   该试剂盒不含样品制备的相关试剂，根据样品种类选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒（货号:RTU5002）；动物总蛋白BN样品制备可以选择动物胞浆活性蛋白提取试剂盒(货号:RTD8106)；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒（货号:RTD8111,RTD8112）；动物线粒体BN样品制备可以选择动物线粒体提取试剂盒（货号:RTD8115和RTD8116)。

2. 电泳：

2.1 拆开预制胶包装，将预制胶安装在合适的电泳槽中。

注：伯乐Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列电泳槽请确保密封条的安装方向（下图）。

六一其他系列，君意东方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等电泳槽可以直接使用预制胶。

不兼容Thermol系列电泳槽。

2.2 准备电泳缓冲液：

将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

2.2.1 CN-PAGE电泳：

阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。

2.2.2 BN-PAGE电泳：

阳极缓冲液使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液按照下表配制：

2.3准备样品：

2.3.1 CN-PAGE电泳：

2.3.2 BN-PAGE电泳：

2.3.2.1 植物类囊体膜蛋白电泳：

*植物类囊体膜蛋白电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：

植物类囊体样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。例如样品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%，则需要G-250终浓度为0.5%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料1 μl。

2.3.2.2 动物线粒体BN样品电泳：

*动物线粒体BN样品电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：

动物线粒体BN样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/8。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.125%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.25 μl。

2.4电泳过程；

2.4.1 CN-PAGE电泳：

电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

2.4.2 BN-PAGE电泳：

BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达凝胶1/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。

BN-PAGE电泳条件（一板胶）

3. 转膜：

BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密，不易去除。转膜后PVDF膜上的蓝色染料可以用无水甲醇漂洗去除。转膜缓冲液推荐使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。

4. 染色：

4.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。

4.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。

4.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。

4.4 观察保存结果。

5. 实验示例：

BN-PAGE 3-12% Precast Gel
稳压120V 1.5 h 1×BN/CN电泳缓冲液 冰浴电泳

BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒压 120V 2 h 1×BN/CN电泳缓冲液 冰浴电泳

K562 膜蛋白BN-WB检测
样品：膜蛋白提取样品用2%DIG和1%DM增溶（ 货号：RTD8111，动物膜蛋白提取试剂盒(细胞)） ，
胞浆蛋白CY做对照
电泳：3-12% BN预制胶（货号：RTD6138-0312），稳压200V 1×蓝色阴极缓冲液至指示前沿距离胶上沿2/3处，
更换为无色1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，电泳时间共83分钟
胶预处理：胶浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min后转膜
转膜：0.45μm PVDF膜，10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）稀释为1×BN转膜缓冲液加20%甲醇，
恒流200mA  2小时，未冰浴。
转膜效果检测：膜用丽春红染色液染色（货号：RTD6301）有可见条带，胶用FastBlue蛋白染色液染色
（货号：RTD6202）几乎无条带，证明转膜成功。膜用无水甲醇清洗5分钟去除膜上蓝色残余。
封闭：Western快速封闭液（货号：WR5020）  RT  封闭10 分钟；
图1 一抗：兔单抗GAPDH 1:10000  RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光6秒
图2 膜使用Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型）（货号：WS1200）37度15min，快封10分钟，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000  RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光1秒