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Tris-Tricine-PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（适用于多肽电泳）     说明书Ver 740056

● 产品组成：

● 产品简介：

该产品含有多肽电泳全套试剂，可以用来检测2.5-20 kD的多肽大小。本试剂盒可配制至少25块常规大小（8×10cm）,厚度1 mm的PAGE胶。该产品具有以下特点：

1 分辨率高：凝胶缓冲液独特配方，可以有效分离2.5-5 kD多肽；

2 使用方便：配制凝胶时只需1:1混合浓缩胶或分离胶溶液，不用计算；

3 易于上样：红色浓缩胶，易于观察加样孔，上样方便。

● 贮存、运输及效期：

按照标签温度贮存；常温运输；有效期一年。

● 使用说明：

一. 10%APS溶液配制：

10% APS为固体粉末，使用前加入5 ml双蒸水溶解即配制成10% APS溶液，将溶液分装后置于-20℃保存，通常一年内有效。该溶液在4℃条件下可以稳定保存两周。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20℃保存的10% APS溶液。

二. 制胶：

1. 配制分离胶:

1.1按照表一将不同体积的成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。                    表1 （一块1 mmmini胶用量）*

注： * 如非必须，不要使用厚度1.5 mm的凝胶，尽量使用厚度1 mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

1.2 在玻璃板中迅速灌入适量分离胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可。注：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.3 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2 cm的无水乙醇层，使凝胶表面保持平整。

1.4 静置10-30分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。分离胶25℃条件下，约20分钟可以聚合。

2. 配制浓缩胶:

去除覆盖在分离胶上的乙醇层，用滤纸将残留的乙醇吸去。

2.1 按照表一将不同成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。

2.2 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

2.3 静置30-50分钟待凝胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。浓缩胶25℃条件下，约40分钟可以聚合。

三. 电泳：

3.1 变性电泳缓冲液和样品配制：

3.1.1 10×Tris-Tricine- SDS缓冲液配制：

将10×Tris-Tricine -SDS缓冲液（10×TTS）粉末（Cat No：CB010P）置于一干净的烧杯中，加入500 ml超纯水，彻底搅拌混匀，不要调节pH，即配成500ml 10×TTS缓冲液。超纯水稀释10倍配成1×Tris-Tricine -SDS缓冲液。

注：伯乐Mini III电泳槽一次电泳使用300-350 ml 1×TTS缓冲液。

3.1.2 变性样品处理：

        待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液（变性，还原）[Cat No：TP050]等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，根据说明书上样（预染Marker不能加热处理，非预染Marker上样前一般要95℃处理5分钟）。

3.2 非变性电泳缓冲液配制和样品配制：

3.2.1 10×Tris-Tricine缓冲液配制：

将10×Tris-Tricine缓冲液（10×TT）粉末[Cat No:CB020P]（试剂盒不提供）置于一干净的烧杯中，加入500 ml超纯水，彻底搅拌混匀，不要调节pH，即配成500 ml 10×TT缓冲液。超纯水稀释10倍配成1×Tris-Tricine缓冲液。

注：伯乐Mini III电泳槽一次电泳使用300-350 ml 1×TT缓冲液。

3.2.2 非变性样品处理：

      待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液（非变性，非还原）[Cat No:TP070] （试剂盒不提供）等体积混合，不要加热，直接上样。

3.3 电泳：

将电泳槽的内槽加满电泳缓冲液，轻柔拔出梳子，用1 ml移液器将梳孔吹洗干净，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（表2），至蓝色考马斯亮蓝指示前沿至分离胶下沿位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2.5-3个小时。

表2 多肽电泳条件

注：稳压电泳，电流不用调节，记录电流数值在推荐范围内，电泳过程中电流会逐渐降低。

四. 染色：

凝胶可以使用常规考马斯亮蓝染色液和脱色液进行染色和观察。需要注意的是，常规染色和脱色方法需要较长时间，小肽由于长度较短，和凝胶结合不紧密，长时间在溶液中浸泡容易从凝胶中脱离。常规染色和脱色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），该产品除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

 实验示例：