免疫學雜誌研究

2014年卷（2014年），文章編號525913，9頁

評論文章

癌症細胞移植療法：過去，現在和未來

Abstract摘要

治療癌症的細胞移植療法在最近取得了迅速的進展，免疫治療已經被認為是手術、化療、放療之後的第四種抗癌模式。用於細胞移植療法的淋巴細胞，包括樹突細胞、自然殺手（NK）細胞、T淋巴細胞，像是腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs ）和細胞毒殺T淋巴細胞（CTLs）。體外激活或改造的免疫細胞可以進入癌組織中引發持久的抗腫瘤免疫反應，這是非常重要且特別的，特別是在接受免疫抑制治療-例如化療之後。在這篇評論文章中，我們綜述對人類癌細胞治療有最新進展的樹突細胞、NK細胞和T細胞的探索

1.簡介

Coley從肉瘤復發患者接受手術後，感染丹毒，結果肉瘤完全消退的觀察得到啟發，於1891年用丹毒鏈球菌和鏈球菌桿菌的混合毒素治療末期肉瘤患者，進而開始了免疫治療人類癌症的歷史。不幸的是，從那時起進展一直是有限的。近日，繼細胞移植療法（ACT）和抗癌抗體的發展，如Ipilimumab(益伏)發展的重大成功，重新喚起了科學界的抗癌免疫治療和細胞激素治療的興趣。現在，免疫療法已被確認為手術、化療、放療之後的第四種抗癌模式。

有兩種類型的癌症免疫治療，主動免疫療法和被動免疫療法。

主動免疫療法主要是指疫苗、免疫刺激劑、和細胞激素。

而被動免疫療法包括免疫調節，以抗體為基礎的治療，和過繼免疫治療。

主動免疫治療可激活體內的免疫系統，被動免疫治療是注入體外產生的抗體，或攻擊型細胞，來提供或加強癌症患者的免疫反應。

在主動免疫治療中，細胞激素包括白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-12（IL-12）、顆粒細胞 - 巨噬細胞聚落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子（TNF）-α和干擾素（IFNs），由免疫細胞分泌並在主動免疫治療時發揮關鍵作用。白細胞介素-2( IL-2)是淋巴細胞重要的生長因子。已被FDA證明能治療晚期黑色素瘤和腎癌。然而，高劑量白細胞介素-2(IL-2)引起的嚴重全身毒性限制了它的廣泛應用

根據免疫細胞移植的細胞種類，細胞移植療法（CTT）可分主動和被動兩種，而樹突細胞移植是最常用來引發抗腫瘤免疫反應的主動細胞移植療法。

而被動的又叫過繼性細胞移植(ACT) ，過繼性細胞移植(ACT)療法，分為使用患者自體的，或使用同種異體但HLA相合的，在體外用生長因子活化的淋巴細胞。

這又分成至少兩種類型。(1). 第一種類型包括淋巴激素激活的殺手細胞（LAK）、CIK（細胞激素誘導的殺手）細胞，和NK細胞，所有這些都可以使癌症消退，沒有MHC(主要組織相容性複合體)的限制。

(2). 另一種類型的攻擊型細胞是指腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和毒殺T淋巴細胞（CTL），這兩個是能識別MHC呈現的特定腫瘤抗原。

2.以樹突細胞為基礎的細胞移植   

在樹突細胞被鑒別為體內有效的抗原呈現細胞後，樹突細胞為基礎的疫苗，被認為是重要的疫苗。樹突細胞具有連結先天免疫，及適應性(後天性)免疫的能力。成熟樹突細胞可以刺激活化自體腫瘤特異性毒殺細胞CD8+ T細胞，減小腫瘤。樹突細胞可以從周邊血液單核細胞（PBMC）分離出來，與多種癌症特異性抗原在體外擴增和激發。

Sipuleucel-T (Provenge)疫苗是第一個獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）在2010年4月被核准用于治療轉移性前列腺癌的疫苗。

Sipuleucel-T疫苗由樹突細胞為基礎，與融合蛋白(PA2024)在體外共同孵化而得，其中PA2024是一種由前列腺分泌的酸性磷酸脢(PAP)和顆粒細胞-巨噬細胞生長因子(GM-CSF)構成的融合蛋白(PAP-GM-csv)。

目前在三個重要的的第III期臨床試驗中，表現有效，能提高中晚期前列腺癌的整體存活期。在一個隨機整合分析的臨床試驗中，共有737例轉移性前列腺癌患者，使用sipuleucel-T與安慰劑治療相比，整體存活率顯現，死亡率顯著較低，危險比值（HR）為0.73(95% CI: 0.61–0.88; )。然而，並沒有拉長疾病惡化的時間（HR=0.89，95％CI：0.75-1.05）。

值得注意的是，沒有嚴重的副作用。相較於對照組，用sipuleucel-T疫苗治療的男性，所有不良事件的匯總相對危險度（RR）（RR=1.03，95％CI：1.00-1.05）、第3級至5級的副作用（RR=0.98，95％CI：0.79-1.22 ;）、腦血管事件（RR=1.93，95％CI：0.73-5.09）都沒有顯著升高。有更多的報告從II / III期臨床試驗顯示出以樹突細胞為基礎的疫苗，效果是令人振奮的，這與疫苗能誘導出腫瘤特異性攻擊型T細胞的結果有關。

未成熟樹突細胞不僅抗原呈現功能很差，還會產生免疫耐受性。因此，關鍵是要促使未成熟樹突細胞成熟和分化，並阻斷身體對外來的樹突細胞的抑制效果。例如，內生性的免疫抑制性的樹突細胞，當給予帶有免疫刺激性的miRNA miR-155時，可轉化為高度免疫刺激性的樹突細胞，誘導抗腫瘤反應。

此外，在那些骨頭和軟組織有腫瘤的患者，白细胞介素-4（IL-4）/ 顆粒細胞-巨噬細胞聚落刺激因子(GM-CSF) / 腫瘤裂解物（TL）/ 腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 這樣的激素組合，能誘導樹突細胞最大分化和成熟，比以下這些組合白细胞介素-4（IL-4）/ 顆粒細胞-巨噬細胞聚落刺激因子GM-CSF / 腫瘤裂解物（TL），或白细胞介素-4（IL-4） / 顆粒細胞-巨噬細胞聚落刺激因子GM-CSF / OK-432製劑的效果都還要強。

樹突細胞可藉遺傳工程，生出VEGF（血管內皮生長因子）接受體，可以中和可溶性VEGF，提升合併刺激分子的表現，和促發炎細胞激素及趨化因子的表現，從而改善抗腫瘤免疫反應。

同樣地，用病毒做載體，加上免疫刺激分子例如CD80/ CD86和白细胞介素-12(IL-12)，一起來轉錄樹突細胞，也是一個不錯的選擇，可提高抗腫瘤免疫反應。

此外，在乳腺癌小鼠實驗中，阻斷免疫抑制酶吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）能增加攻擊型T細胞的增生和活性，和降低人類調控T細胞(Treg CD4（+）CD25（+）Foxp3（+）)的數目。

在結腸癌的小鼠實驗中，樹突細胞的疫苗，結合CTLA-4阻斷，和通過anti-CD25抗體清除人類調控T細胞，可提高腫瘤根除率。

3.以自然殺手細胞為基礎的細胞移植

自然殺手細胞，呈現的定義是淋巴細胞CD3−CD56+，能迅速溶解某些指定細胞而不MHC限制。自然殺手細胞的細胞毒性，主要是決定於活化信號和抑制信號之間的平衡。自然殺手細胞抑制型接受體，包括免疫球蛋白受體（KIRs）和CD94/ NKG2A/ B，可以針對幾乎所有正常細胞中都會呈現的MHC I分子進行抑制，因此正常狀態下，自然殺手細胞殺傷活性被抑制，不會傷到自己的正常細胞。

自然殺手細胞能被激活，以殺死那些調降MHC-I 表現的細胞。因此，當腫瘤細胞想躲避免疫監視，故意呈現低MHC-I特性時，正是自然殺手細胞發揮抗腫瘤作用的時候。某些MHC-I-充足的腫瘤細胞也能逃過自然殺手細胞，因為自然殺手細胞偵測壓力誘生的配體，腫瘤細胞通過自己的活化性受體，例如NKG2D受體，來躲過NK細胞。

因此，可以通過使用抗體，阻斷自然殺手細胞的抑制性受體，或抗體結合掉腫瘤細胞的活化性受體，來增加自然殺手細胞的┌溶解細胞能力」。例如，抗體阻斷KIR(一種抑制型接受體)，在人癌症模型，顯著促進自然殺手細胞毒殺（ADCC）的能力。另一實驗顯示，使用RNA干擾，觀察到抑制型NKG2A受體變得無用了，自然殺手細胞細胞溶解力增加40％。

另一新療法，作用在腫瘤細胞而非正常細胞的活化性接受體NKG2D上，目前取得了臨床試驗的成功。

NK細胞有幾個來源，包括自體NK細胞、同種異體的NK細胞、NK細胞株(廠商做好的)、基因改造的NK細胞、造血幹細胞（HSC），和誘導性多功能幹細胞（iPS）。通過細胞激素刺激，自體NK細胞可以轉化為淋巴激素激活的殺手細胞（LAK）(也就是我們說的NKT)，並表現出更大的抗腫瘤細胞毒殺力。在1985，羅森伯格。介紹用LAK細胞，治療頑固型轉移性黑色素腫瘤。 25個病人當中的11例客觀的呈現出癌症消退，其中包含一個是有腫瘤完全消退長達10個月的經驗。這是一個令人興奮的成果，開創了免疫治療的新時代。這個令人興奮的成就，開創了免疫治療的新紀元。然而，根據其隨後所得II期和III期臨床試驗報導，利用LAK結合IL-2治療，約15-20％臨床緩解率。這個結果並不優於IL-2單獨治療。這個低成功率是因為LAK被抑制性接受體KIRs，或IL-2誘生出的調控性T細胞(Tregs)，阻止了攻擊力。

同種異體反應性的NK細胞，與病人的抑制性接受體KIRs 不配對，因此可以克服以上障礙，並且在急性骨髓白血病（AML），不會導致移植物抗宿主疾病(排斥)，呈現出更好的腫瘤殺傷力。

至於實體腫瘤，同種異體NK細胞也有治療效果，而且壞處很小。在一個第I期臨床試驗中，用IL-15和氫化可的松（HC）在體外培養的同種異體NK細胞的過繼移植，合併化療，被發現安全且可能有效治療晚期非小細胞肺癌的。但由於MHC不匹配的缺點，這種方法可能產生排斥反應。

與自體或異體NK細胞相比，NK細胞株(廠商做好的)，可以在良好生產規範的條件下（GMP）提供足夠數量在臨床上治療更方便，更簡單的程序擴展。FDA批准唯一能治療的NK細胞是NK-92細胞，治療晚期惡性黑色素瘤和腎細胞癌。然而，其他的NK細胞株如KHYG-1細胞，展示出比NK-92細胞更高的抗腫瘤效果。

強有力的證據支持了NK細胞的基因改造是另一種有效的策略，以提高腫瘤細胞的殺傷率。基因操作方法包括轉基因細胞激素的表現，提升活化受體，壓制抑制性受體，並經由嵌合腫瘤抗原特異性受體，重新定向NK細胞。

最近，有發現組織特異性NK細胞，以不同的型態表現，並根據器官扮演不同的免疫作用。例如，肝NK細胞能殺死腫瘤細胞對脾NK細胞則有抗性。因此，不同器官的癌症，可能要用不同組織特異性NK細胞來治療。

到目前為止，過繼性細胞移植ACT與NK細胞主要在血液腫瘤患者，已經顯示出可喜的成果。相反的，NK細胞為基礎的治療，對實體腫瘤，仍不能令人滿意。例如，在8個轉移性黑素瘤或腎細胞癌患者，用自體NK細胞，合併淋巴細胞清除--化療藥物處理後的臨床試驗中，雖然高量的NK細胞循環持續數個月，但並沒有觀察到腫瘤消退。

回輸到捐助者之前NK細胞的激活是至關重要的。例如，NK細胞用IL-12 / IL-15 / IL-18的事先活化，而不是IL-2，更能快速擴增，產生高量的干擾素γ（IFNγ），誘導腫瘤消退。

以上兩種來說， NK細胞為基礎的治療，只取得了中等的臨床成功案例，NK細胞在體外的活化，NK細胞作為基礎的癌症臨床治療的效度，都要再提升。 

4.T細胞為基礎的細胞移植

(1)Cytokine-Activated T-Cell 激活的T細胞

細胞激素激活的T細胞是CD3陽性和CD56陽性的異質體，不受限於MHC的一種自然殺手樣T細胞(NKT)。來自於周邊血液淋巴細胞（PBL），在體外用抗CD3抗體，和各種細胞激素如IL-2，IL-1，和IFNγ一起培養。相對於淋巴激素激活的殺手樣T細胞（LAK），細胞激素激活的殺手樣T細胞，具有較強的細胞毒殺力。此外，細胞激素激活的CIK細胞與樹突細胞(DC)共同培養，可以產生DC-CIK細胞，具有強大的增殖力，顯著的細胞毒殺力，分泌充足細胞激素，高度呈現淋巴細胞受體TCR等功能。目前，CIK細胞正在廣泛測試應用到腎癌，胃腸癌，晚期NSCLC（非小細胞肺癌)等。

腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），是從剛切除的腫瘤分出來，在體外用IL-2培養，可引導腫瘤細胞溶解。腫瘤組織中的主要攻擊細胞是毒殺CD8 + T細胞，其抗腫瘤作用，可用白細胞介素-2(IL-2)提高。羅森伯格和他的同事們在1988治療已經轉移的黑色素瘤患者，首次採用腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）過繼移植，效果卻不令人滿意。直到2002，令人興奮的結果來了! 原因是過繼移植前做了淋巴清除。在這個臨床試驗中，九十三例已轉移的黑色素瘤對標準治療無效，先做化療或2格雷或12格雷放射照射，然後聯合輸注自體腫瘤浸潤淋巴細胞與IL-2。客觀反應率，依照「實體腫瘤療效評估標準」（RECIST），)，反應率從49%到72%，比率隨事前淋巴清除的程度而增大。93例（22%）中有20例觀察到完整的腫瘤消退，且有19例患者持續消退達37至82個月。消除抑制性T細胞，或減少內源性淋巴細胞對細胞激素IL-7或IL-15的競爭，可能是增强腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）功能的原因。儘管這一令人鼓舞的結果，但腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）仍存在著明顯的缺點。首先，它是昂貴和耗時的。第二，CD4+CD25+調控性T細胞（Treg細胞）會抑制抗腫瘤反應，而培養所用的IL-2，會刺激Treg細胞的膨脹。第三，大約只有50%的黑色素瘤腫瘤找得到腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），而許多其他類型癌很少含有足够的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）。最後，淋巴清除需要患者有更好的身體狀況。

在免疫學的新進展是，如何提高腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）臨床療效。例如，通過更換IL-2，改用 IL-7和IL-15可以有效防止Treg增殖。另外，抗CD25單株抗體可消耗掉CD25（+）調控性T細胞。

除細胞激素外，培養液中的化學物質也能影響移植後的細胞功能。例如，用雷帕黴素(Rapamycin)處理的T細胞，表現出雷帕黴素抗性，能在移植後，在體內抗凋亡，持久性更好。

(2)基因改造T細胞

為了克服上述限制，另一種方法是直接基因改造自體淋巴細胞。T細胞的功能可以通過基因改造來改善，1. 例如下調BID，2. 或上調BCL-XL和BCL-2，3. 插入CTLA-4變異基因，4. 感染人類c-fms基因分泌巨噬細胞聚落刺激素（CSF-1），5.轉錄CXCR2，CCR4或CCR2B產生較優遷移力，6. 改造表達PD1-CD28嵌合體，克服免疫抑制。此外，T細胞還可以被改造，產生能識別腫瘤的接受體。

有兩種類型的抗腫瘤接受體，一個是自然產生的T細胞受體（TCR），另一個是嵌合抗原受體（CARs）。TCR是一個異源二聚體α和β鏈，能識別抗原，需要MHC呈現，嵌合抗原受體（CARs）辨識和結合到抗原，不需MHC呈現。

T細胞接受體(TCR)基因可以來自黑色素瘤的腫瘤浸潤T細胞，或來自能表現人類MHC基因的轉基因小鼠。此外，噬菌體也可以產生腫瘤特異性TCR基因。

然後，用反轉錄病毒或Lenti 病毒做載體，來轉錄能識別腫瘤相關抗原(TAA)的T 細胞接受體(TCR)基因。摩根和他的同事們成為了第一個成功運用基因改造，使T細胞含有結合MART-1抗原(MART-1: 黑色素細胞/黑色素瘤分化)的接受體。在15名漸進轉移黑色素瘤患者中，有2例表現出客觀消退（1例完全反應，1例部分消退）在輸液後1年，還持續在循環中找到基因改造的T細胞（70%和20%）。雖然在這個小試驗效果低於直接移植腫瘤浸潤T細胞，但基因改造出配有特定TCR的T細胞被證明是有效的，且應用擴展到其他實體腫瘤，例如滑膜細胞肉瘤、結腸直腸癌、腎細胞癌的臨床試驗中。

選擇腫瘤特異性抗原似乎是至關重要的。T細胞接收體的後續研究，發現黑色素瘤的MART-1和gp100h這兩種抗原，被報導有標靶毒性像是白斑病、葡萄膜炎及聽神經毒性，因為MART-1和gp100h在正常黑色素細胞也有少量。此外，心肌細胞某種不相干的蛋白質表現出的不相干的胜肽，會造成嚴重的心血管毒性。因此，最大的挑戰是要找到沒有在正常組織表現出來的腫瘤相關抗原。睪丸癌抗原是有希望的目標抗原，因為它們被呈現在各種上皮細胞癌和睾丸上，卻不在一般正常細胞上，而且缺少MHC I，可避免睪丸被攻擊。

在臨床試驗中，自體移植配有針對NY-ESO-1抗原的（一種癌症睾丸抗原）接受體的T細胞，來治療轉移性滑膜細胞肉瘤和皮膚黑色素瘤，6位有滑膜細胞肉瘤中的4位，和11位皮膚黑色素瘤患者中5位有效。重要的昰，沒有一位患者表現出毒性。除了NY-ESO-1之外，還有更多在研究的睾丸癌抗原，例如MAGE-A3和SSX2。但是，基因改造的T細胞接收器有一些缺點，基因改造的T細胞接受體α-和β-鏈，會與內源性的T細胞接收體錯配，減少基改T細胞表面接收體的呈現，降低抗腫瘤的功效。一個減少錯配的創造性方法是，引進小分子的干擾RNA基因編碼，或鋅指核酸酶，下調內源性的T細胞接收體的表現。此外，腫瘤有可能透過下調的MHC呈現，去抑制T細胞接受體識別腫瘤抗原。一樣的原因，TCR只能辨識由MHC分子呈現的胜肽，不能被辨識碳水化合物抗原和醣脂抗原。與TCR 相反的是，嵌合抗原CARs卻能克服這些障礙。CARs是基改免疫受體，能結合癌細胞表面呈現的特定抗原，然後激活T細胞，以消除腫瘤細胞。通常，CARs結構有以下組合: 1. 細胞外的TAA特異性單鏈抗體變異片段（scFv）、2. 分子的鉸鏈區、3. 橫跨膜的主體，和4. 在細胞內的信號區。單鏈抗體變異片段可以鎖定不需MHC呈現的腫瘤抗原。因此，該技術可以不論其HLA型態而適用於所有個體，而且它也可以識別碳水化合物抗原和醣脂抗原。橫跨膜主體與CARs的二聚作用，和激活T細胞有關。CARs超越TCR最大的優點是CAR可以不受MHC限制識別腫瘤相關抗原。此外，自然殺手細胞和CIK細胞也可以配置CARs。第一代的CAR包含scFv和ITAM (免疫受體酪氨酸激活基序）。儘管由最初的實驗證明T細胞配置CARs的可行性，T細胞只短暫的增加(不能在體內活太久)及分泌細胞激素過少，都使抗腫瘤力偏低。第二代的CARs是藉由整合1. 共同刺激分子CD28, CD27, CD134, CD137, CD244，2. 誘導共同刺激(ICOS)，3. LCK SRC激酶，到細胞內信號區。幾項研究已經表明，第二代CARs增強T細胞功能和持久性，可以增加細胞激素的分泌和上調抗凋亡蛋白的產生，進而能更完整的清除腫瘤。而第三代的CARs加入額外的共同刺激信號區（例如，CD28 /4-1BB/CD3ζ，CD28/ OX-40 /CD3ζ），從而進一步提高T細胞傳遞信號的能力。

令人興奮的是，由Pule在2008年完成第一個CARs臨床實驗。他們治療了11位有神經母細胞瘤的病患，用EB病毒特異性的毒殺T細胞，配有針對神經節苷脂GD2的嵌合抗原受體(CARs)。腫瘤壞死或消退，甚至持續性完全消退的現象，八位中就有四位患者。然而，最令人印象深刻並成功的報導是，T細胞配有針對細胞表面蛋白質CD19的CARs，用來治療B細胞淋巴瘤患者。CD19在正常成熟的B細胞、惡性B細胞、B細胞的前身、及漿細胞裡都有。患者經歷了戲劇性的淋巴瘤消退。另一個鼓舞人心的臨床實驗是患有末期B細胞惡性腫瘤的8位病患採用化療，合併T細胞配置抗CD19的CAR接受體，再加IL-2脈衝治療，有6位病患獲得消退，而所有抗CD19的 CAR細胞基因持續在這些病患的血液中循環。目前，CARs的應用已經擴展到各種像CLL（慢性淋巴細胞白血病），ALL（急性淋巴細胞白血病），非霍奇金淋巴瘤，急性骨髓性白血病（AML），腎細胞癌（RCC），結腸直腸癌，和卵巢癌。

不幸的是，使用CAR工程的T細胞有多種副作用。摩根報導轉移性結腸癌病人輸液配有抗ErbB2嵌合抗原受體(CARs)的T細胞後，發生急性呼吸衰竭，五天後死亡。可能的的理由是，基改的T細胞識別到帶有ERBB2抗原的正常肺細胞，和分泌出的炎性細胞激素如TNF-α和IFN-γ，造成肺毒性和多器官功能障礙綜合症

T細胞的分化狀態更是最大的問題，最大限度地影響T細胞的抗腫瘤作用。加蒂諾尼和他的同事們發現了一個具有幹細胞性質的人類記憶T細胞亞群，被稱為記憶幹細胞（TSCM），在小鼠模型中，它可以誘導比中央記憶T細胞（TCM）和攻擊型記憶T細胞（TEM）更大的抗腫瘤反應。低分化T細胞在體內具有較好的增殖能力和抗腫瘤作用。另外，造血幹細胞也是長期植入的理想型。人類CD34+幹細胞可以從周邊血分離和加以基因改造配上腫瘤特異性受體。這些細胞被注入實驗的小鼠，並產生了相當數量的黑色素瘤特異性T細胞，可以長期存在於體內。

(5)Conclusions and Perspectives結論與展望

與其它標準療法，如化療，放療和手術相比，免疫治療由於具有高度特異性的蛋白/受體蛋白質相互作用，能夠提供準確度高的精準治療。激活或改造的免疫細胞能誘發持續的抗腫瘤免疫反應。目前大多數臨床實驗證實是有希望的，儘管是中度的臨床療效。然而，臨床研究建議，結合免疫療法或與其他傳統療法如化療和放療，對腫瘤反應和總生存率是有相輔相成的影響。此外，要達到最好的臨床療效，找出最佳劑量和時間表，仍然是一項挑戰。但吸引人的是，免疫治療將佔有重要的地位，並將成為癌症的標準治療。