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國際期刊論文公開資訊: https://www.mdpi.com/2223-7747/13/4/537

安全農業：超微氣泡水可減少昆蟲侵襲並提高甜瓜產量和質量

作者：楊境界, 李寧娟, 彭慶彥, 洪若綺, 辜瑞雪

摘要

        過去農民對於田間瓜類病蟲害防治多依賴頻繁的噴施農藥，但因應永續性和全球性人類的健康，減少農藥噴灑已成為十分重要的議題。因此，開發可持續且生態友善的新種植系統非常重要。這項研究發現，與用逆滲透（RO）水灌溉的對照組相比，用富含有H₂和O₂的超微氣泡水（UFW）灌溉的瓜苗可產生更多的根毛，增加植株高度，並產生更多的花朵。我們還發現超微氣泡水灌溉後顯著減少了瓜類中的蚜蟲侵擾。根據冷凍掃描電子顯微鏡 (cryo-SEM) 觀察，UFW 處理增強了毛狀體(trichome)的發育並防止了蚜蟲侵襲。為了解是超微氣泡水中H₂還是O₂有助於阻止蟲害，我們分別製備了H₂（UF+H₂）和O₂（UF+O₂）超微氣泡水用以灌溉甜瓜。Cryo-SEM結果顯示，UF+H₂和UF+O2均可增加甜瓜葉片和葉柄毛狀體的密度。 RT-qPCR 顯示，UF+H₂ 顯著提高了毛狀體相關基因 GLABRA2 (GL2) 的基因表現量。在田間溫室試驗中，個別使用富含氫（UF+H₂）和富氧（UF+O₂）超微氣泡水灌溉甜瓜。結果指出，植株生長參數及果實生長性狀包括: SPAD值、光合作用參數、根重、果實重、果實甜度均優於未使用超微氣泡水灌溉的對照組。本篇研究顯示UFW 顯著促進毛狀體發育、增強抗蟲性並改善果實性狀。 因此，透過超微氣泡水澆灌系統為害蟲防治和永續農業生產提供了一個嶄新的作物管理方式。

前言

        超微氣泡水（UFW）也稱為奈米氣泡或微氣泡水，含有直徑小於100 nm的小分子，可在其表面攜帶氣體[1]。 UFW水快速滲透土壤，可以更有效地被根部吸收，促進植物生長和發育。 其在農作物生產上得到了廣泛的應用[2,3]。 根據過去的報告指出，用超微氣泡水灌溉的植物可以提高種子發芽率[4-6]，顯著增加根和不定根發育[7]，並強化根部養分吸收和提高養分利用效率[8]。 許多報告顯示，超微氣泡水灌溉提高了農作物的產量和質量，例如水稻[9]、生菜[10]、番茄[11,12]、黃瓜[13]、甜瓜[14]和草莓[15]。

       富氫超微氣泡水可延長花卉的瓶插壽命及切花品質[16,17]。 此外，它還延長了奇異果 [18] 和草莓 [19] 的保鮮。 它在植物對非生物性逆境的耐受性中也扮演著重要角色。氫氣預處理可以提高水稻和阿拉伯芥對鹽逆境的抗性[20]。根據前人報導，分子氫（H₂）具有抗氧化活性，可去除活性氧（ROS）和活性氮（RNS）並降低自由基毒性[21,22]。

       甜瓜在全球市場上具有重要的經濟價值，但甜瓜作物容易受到多種蟲害如蚜蟲、薊馬、粉蝨、黃瓜甲蟲和紅蜘蛛的侵害[23]。 蚜蟲是一種微小的昆蟲，它們從植物中吸取汁液，會導致生長發育不良、葉子捲曲、傳播病毒並降低作物產量。蚜蟲傳播的瓜類黃瓜花葉病毒（CMV）和西瓜花葉病毒-2（WMV-2）等病原體對瓜類植物造成嚴重損害，導致產量下降和果實品質下降。因此，農民頻繁噴灑農藥，導致食品安全問題。因此，開發一種新的種植系統，用於甜瓜生產中符合農業和環境永續評估（SAFE）[25]非常重要。

       毛狀體是植物器官（如葉、莖和花）表面長出的毛狀物。 毛狀體為食草昆蟲的物理屏障，阻止食草昆蟲嚼食並減少昆蟲的移動。已知毛狀體密度較高的植物對昆蟲的抵抗力較強[26]，且毛狀體密度與昆蟲抗性之間具有強烈的正相關性[27]。此外，腺型毛狀體還可以產生對昆蟲有毒或具有驅避作用的揮發性化合物[28]。茉莉酸（JA）是可經葉片受傷後誘導的激素，它參與萜烯生物合成[29]。經茉莉酸甲酯（Me-JA）處理顯著增強部分單萜和倍半萜合成酶的表達。 研究表明，剔除 HD-ZIP IV 轉錄因子 (TF)  會導致毛狀體顯著缺陷和萜烯水平降低，並且與番茄的抗蟲性相關 [30]。 Me-JA 誘導新生的番茄葉片上 VI 型—腺型毛狀體的形成，從而減少食草昆蟲數量 [31]。其實控制毛狀體發育的基因調控路徑十分複雜[32]，受 GLABRA1 (GL1)、GLABRA2 (GL2)、GLABRA3 (GL3) 和 TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG) 等基因的調節。當這些轉錄因子功能的喪失後，植株則表現出無毛狀體[33-39]的表型。 GLABRA3 (GL3) 是一種可經傷口而誘導毛狀體的形成，位於 JA 訊息傳遞路徑下游 [35]。 TRIPTYCHON (TRY) 是毛狀體和根毛發育的負調節因子 [40]。據報道，菸草[41]和水稻[42]中茉莉酸介導的腺型毛狀體發育需要JAZ的參與。

       過去十年來，氫在農業中的應用引起了廣泛關注[43]。然而，目前尚未有關於 UFW 誘導的 JA 和促進植物毛狀體發育增加的相關報導。本篇研究的目的如下：（i）觀察UFW是否促進瓜苗生長及果實產量；(ii) 瞭解UFW是否增強害蟲抗性；(iii) 瞭解 UFW 是否會影響 JA 生合成路徑並誘導甜瓜毛狀體發育。

結果

2.1超微氣泡水處理促進瓜苗的生長

       為了瞭解超微氣泡水 (UFW) 對種子發芽和幼苗生長的影響，我們測試了四種甜瓜品系：M1、M2、M3 和卡蜜拉。 每品系四十顆種子以超微氣泡水和逆滲透水中浸種並放置隔夜，而後分別放置在含有超微氣泡水和逆滲透（RO）水作為對照（CK）的方形培養皿中。 然後將培養皿置於黑暗的生長室中並設定為 28°C 的恆溫。 發芽一天后，UFW 中的甜瓜種子的根比CK 中產生更長且有更多的根毛（圖 1A）。 UFW 處理的 M2、M3 和 Camilla 種子的發芽率高於 CK（圖 1B）。我們將發芽的種子移植到裝滿泥炭土的＃104孔穴盤中，並在溫室中育苗。 移植後 7 天，用 UFW 處理比 CK 產生更有活力的根和幼苗（圖 1C）。

圖 1. 超微氣泡水影響甜瓜種子的發芽和根系。 (A) 超微氣泡水 (UFW) 對甜瓜種子發芽的影響。 四個甜瓜品種，每個品種有 40 顆種子，在含有 RO 水和 UFW 的培養皿中發芽。 箭頭顯示種子發芽後 1 天根部的根毛。(B) 瓜子發芽後7天的發芽率。(C) 播種後 7 天 (DAS) 在含有泥炭蘚的穴盤中生長的瓜苗。 箭頭顯示根部發育旺盛。

2.2超微氣泡水減少幼苗的蚜蟲侵襲

       將甜瓜苗從穴盤中移入盆中，並將其放入同一生長室中生長，以 RO 水和超微氣泡水進行灌溉。移植後14天，結果顯示UFW灌溉的甜瓜品系M2和M3的株高比CK更高，開花數更多（圖2）。我們發現移植後14天（DAT），蚜蟲會攻擊生長室中的瓜苗。令人驚訝的是，我們發現用UFW灌溉的瓜類葉片和花蕾中的蚜蟲密度明顯低於對照組（圖3 A-C）。我們應用冷凍掃描電子顯微鏡觀察發現，CK 的毛狀體較少且下垂，蚜蟲的口器可容易到達葉面（圖 3D）。然而，UFW 灌溉的瓜植株具有直立且密集的毛狀體，會干擾蚜蟲的移動和取食（圖 3E）。

圖2.超微氣泡水灌溉對瓜苗生長的影響。 (A) 甜瓜盆栽植物在移植後 14 天 (DAT) 的表現。(B) 量化後甜瓜的株高。 (C) 14 DAT 時每株植物的開花數散佈圖。

圖 3. UFW 灌溉可減少甜瓜苗上的蚜蟲侵襲。 (A) 移植後 14 天被蚜蟲侵襲的瓜葉的表型。(B) 蚜蟲感染評級的散佈圖。 0 級表示未觀察到蚜蟲，9 級表示蚜蟲密度較高。(C) 蚜蟲攻擊甜瓜的花苞。(D) Cryo-SEM 顯示 CK (D) 和 UFW (E) 的花苞上有蚜蟲侵襲。箭頭指向蚜蟲。

2.3. 富含氫氣（UF+H₂）或富含氧氣（UF+O₂）超微氣泡水對毛狀體發育

        我們先前的實驗顯示，同時含有 H₂ 和 O₂ 的超微氣泡水顯著增加了毛狀體密度並阻止了蚜蟲侵擾（圖 3）。因此，我們有興趣知道這種現像是透過 H₂ 還是O2 分子的影響所造成的。為此，我們分別製備了富含純氫（UF+H2）、純氧（UF+O₂）和RO水（CK）的超微氣泡水來灌溉甜瓜品種「卡蜜拉」。在解剖顯微鏡觀察下，與UF+O₂或CK灌溉的瓜苗相比，用UF+H₂灌溉的瓜苗在中段葉柄上產生了更長、更密的毛狀體。 我們拍照並測量葉柄中的毛狀體密度，發現經UF+H₂和UF+O₂灌溉可顯著增加了毛狀體密度（圖4A，D）。在冷凍電子顯微鏡下觀察，經UF+H₂或UF+O₂灌溉後，甜瓜主葉脈產生長單細胞毛狀體和腺型毛狀體。然而，CK 的主葉脈則沒有腺型毛狀體（圖 4B）。與CK相比，UF+H₂或UF+O₂灌溉的瓜葉主葉脈腺毛形態為多細胞，具有中長的柄和球狀的分泌頭部（圖4B，藍色箭頭）。於UF+H₂ 和 UF+O₂ 灌溉後，背面葉片的毛狀體密度比 CK 更密集（圖 4C、D）。同時，我們進行了 RT-qPCR，發現 UF+H₂ 灌溉後，毛狀體發育標記基因 GLABRA2 (GL2) 的正調節因子在幼葉中顯著增加（圖 4E）。

圖 4. 富含氫或富含氧之超細水灌溉影響甜瓜毛狀體的發育。(A) 分別以富含氫(UF+H₂)、富含氧(UF+O₂)和RO水(Ck)超細水灌溉後瓜葉柄毛狀體發育於解剖顯微鏡下觀察。(B) 冷凍掃描電子顯微鏡 (cryo-SEM) 顯示葉片主脈上的毛狀體。(C)冷凍掃描電子顯微鏡顯示甜瓜幼葉背面毛狀體的發育。(D) 以 RO 水、UF+H₂ 和 UF+O₂ 灌溉後的瓜葉柄中的毛狀體密度。箭頭顯示毛狀體。 藍色箭頭表示顆粒狀毛狀體的存在。(E) RT-qPCR 顯示 UF+H₂、UF+O2 和 RO 水對照 (CK) 灌溉的幼瓜葉中 GLABRA2 (GL2) 基因表現模式。

2.4氫誘導植物體內茉莉酸的累積

       我們檢測了瓜葉中的茉莉酸(JA) 和 甲基化茉莉酸(MeJA) 含量，發現與 CK 相比，UF+H₂ 處理下的 JA 顯著增加6.9 倍（圖 5A）。儘管 UF+H₂ 和 UF+O₂ 略微增加了 MeJA 含量，但在 p = 0.05 時則沒有統計上的顯著差異（圖 5B）。 我們的RT-qPCR 顯示，在UF+H₂ 處理後，JASMONATE ZIM 結構域蛋白(JAZ) 和JA 羧甲基轉移酶(JMT) 這兩個基因有上升，但在p = 0.05 時則沒有統計學顯著差異（圖5C） 。

圖 5. 經富含氫和富含氧的超微氣泡水灌溉後其甜瓜中茉莉酸 (JA) 和甲基-JA (MeJA) 含量以及基因表現。(A) JA 含量。(B) MeJA 含量。(C) JASMONATE ZIM 結構域蛋白 (JAZ) 和 JA 羧基甲基轉移酶 (JMT) 的基因表現量。 將基因表現量標準化為兩個管家基因：肌動蛋白 (ACT,MELO3C023264) 和 ADP 核糖基化因子 1 (ADP，MELO3C023630)。

2.5超微氣泡水對甜瓜光合作用參數、果實產量及品質的影響

         我們在溫室中種植甜瓜，以瞭解超微氣泡水+氫氣和超微氣泡水+氧氣灌溉對甜瓜果實產量的影響。 除灌溉用水外，所有作物管理實務均依一致。 我們分別使用 SPAD 計和 Li-600 孔隙度計/螢光計測量了葉綠素含量和光合作用參數。 結果表示，H₂和O₂顯著提高了SPAD值（代表葉綠素含量）和氣孔導度（gsw）。 UF+O₂ 增加了根據螢光 (ΦPSII) 和電子傳輸速率 (ETR) 計算的 PSII 的量子產率（圖 6）。

        在甜瓜成熟後期的生長過程中，用UF+H₂或UF+O₂灌溉的植株比用自來水灌溉的CK保留了更多的綠葉（圖7A，箭頭）。 UFW灌溉後，甜瓜根系發育較為旺盛，其根部鮮重和乾重均顯著高於對照組（圖7B-D）。 UF+H₂ 灌溉增加了瓜果的大小和重量（圖 7E、F）。 此外，UF+H₂ 和 UF+O₂ 灌溉均能增加甜瓜果實的甜度（圖 7G）。

圖6. 超微氣泡水灌溉對甜瓜-卡蜜拉其光合作用能力的影響。(A) 瓜類中的葉綠素含量。 SPAD值在果實成熟後期的第4片葉上測定。以Li600氣孔計/螢光計檢測（B）氣孔導度（gsw）的光合作用參數；(C) ΦPSII，由螢光計算得到的 PSII 的量子產率；(D) L1 瓜葉的電子傳遞率 (ETR)。

圖 7. UFW 灌溉對卡蜜拉甜瓜的果實重量和甜度的影響。(A) 甜瓜種植在溫室中，於授粉後 42 天所拍攝植株生長的照片。(B)採收後的根系發育情況。(C)每株植物的根鮮重。(D)每株植物的根乾重。(E) 採收後 5 天的甜瓜果實。(F) 甜瓜的平均果實重量。(G)甜瓜果實的甜度。

討論

       本研究表明超微氣泡水灌溉顯著改善了甜瓜種子的發芽、幼苗的生長，並促進了根系的發育。我們的溫室試驗中還指出，UFW 富氫氣 (UF+H₂) 或氧氣 (UF+O₂) 產生的根生物量比未經 UFW 處理的對照更高。旺盛的根系發展有助於植物的生長和發育。先前的研究顯示，富氫水可以增加生長素和 GA₃ 的生物合成並促進根系發育 [44]。它調節血紅素加氧酶-1/一氧化碳途徑並增加根部發育[13]。先前研究人員認為，氫具有抗氧化特性，有助於減少植物的氧化，提高植物對養分的吸收，並改善植物的整體生長和發育[6,8,10,13,22]。 氫分子不容易應用。儘管如此，水電解產生的氫氣很容易融合成超微氣泡水，為農業應用提供了良好的解決方案。

       我們的數據顯示，與先前關於黃瓜 [45] 和玉米 [46] 的報告相比，UFW 對作物生產產生了正向的影響。 這結果指出，富氫水比富氧水更好。與富氫水相比，富氧水對植物生長影響的研究還很少。最近，一份報告強調，奈米氣泡水中富集氧氣可以改善土壤結構和微生物多樣性，進而提高番茄產量[47]。 UFW 富 O₂ 可增強向土壤的氧氣輸送並促進有氧呼吸 [48]。一些報告明載，UFW 中的高 O₂ 含量並不一定會帶來更好的作物性能。 在先前對溶解氧（DO）濃度為 10、20 和 30 mg/L 處理的玉米的研究中，20 mg/L 的中等 DO 濃度具有最高的根系生長和產量[46]。 在這項研究中，我們在通風良好的泥炭蘚無土培養基中種植瓜類，這可能會降低 UFW 的正面作用。 如果 UFW 灌溉通氣不良的高密度黏土田，預計會產生更顯著的影響。 據推測，UF+O₂ 可能有利於植物在淹水引起的缺氧條件下生存。

        我們觀察到，用UF+H₂或UF+O₂灌溉的甜瓜在瓜類發育後期保留了較多綠葉，且葉子含有較高的葉綠素。這是一個對於甜瓜採收十分有益的性狀，它可以提高光合作用速率並產生更多用於果實發育的同化物，進而增加甜瓜的果實重量和甜度（圖7）。 如同先前所報導的，富氫水增加了草莓果實的風味和品質[15]。

       據報導，非腺性毛狀體在針對昆蟲的物理防禦機制中發揮作用，而腺性毛狀體則以化學防禦機制，分泌萜烯等代謝物[49]來抵禦昆蟲。在本次研究中，用超微氣泡水（UF+H₂ 和 UF+O₂）灌溉後，在甜瓜葉片主脈中發現了腺性毛狀體，但在對照組中沒有發現腺性毛狀體（圖 4）。據我們所知，本次研究為第一次報導超微氣泡水可以增加毛狀體密度並誘導腺性毛狀體發育的報告。我們發現 UF+H₂ 可以誘導 JA 生物合成基因並促進根和毛狀體的發育。毛狀體可以阻止食草動物並減少昆蟲的損害。 未來，值得研究 UFW澆灌後所誘導產生的次級代謝物。

       過去研究已知 JA 參與毛狀體發育 [30,31]。在本次研究中，我們發現毛狀體起始標記基因GL2表現量在UF+H₂ 處理後在幼葉中顯著增加（圖4E），進一步支持氫氣可能誘導JA 並加強毛狀體發育以防止草食性害蟲侵擾並改善植物生長的觀點。本次數據顯示，使用超微氣泡水（H₂ 和 O₂）灌溉甜瓜可提高甜瓜對蚜蟲侵染的抵抗力（圖 3）。此外，我們發現，由於 JA 生物合成基因的增加和用 UFW 富含 H₂ 灌溉的植物中 增加JA 的累積，因此富含H₂ 的 UFW在毛狀體發育中起著重要作用（圖 5）。 這增強了毛狀體的形成並阻止了昆蟲或干擾了它們的攝食和生長，使植物不易受到損害，進而減少透過害蟲所傳導的系統性病毒感染問題。總體而言，這些數據表明，在 GL2 基因表現增加的情況下，富含氫水可提高 JA 路徑相關基因並促進甜瓜毛狀體發育及增加球狀毛狀體的密度可有助於抵抗蚜蟲。未來值得對 UFW 誘導 JA、增強毛狀體發育以提供植物增加昆蟲抗性的潛在機制進行更廣泛的研究。

       我們證明，UFW 增加了毛狀體密度並干擾蚜蟲取食（圖 3 和 4）、誘導更多花朵的數目、增加果實重量，並提升果實的甜度（圖 7）。 所有這些正向的效果都有助於甜瓜作物的生產。這些結果顯示，在田間使用富含氫水管理作為農作物天然且無毒的害蟲和疾病控制處理，具有卓越的潛力。透過UFW 誘導的 JA 反應有助於作物植物針對昆蟲攻擊的自然防禦系統的建立，可減少農藥噴灑並改善糧食安全。 因此，在農業安全的前提下，不依賴農藥同時可以提高農作物產量和水果質量，這是一種環境友善的農業實踐。此外，UFW具有疏水性和表面電荷特性，可增強土壤養分的釋放和吸收，進而減少肥料需求[9]。 這將減少農作物生產的碳足跡，實現永續農業生產。一些研究強調透過基因工程毛狀體基因來增強昆蟲抗性，但由於消費者對基因改造生物（GMO）的生物安全性的擔憂，本次研究提出了一個更容易被消費者接受的富含氫超微氣泡水灌溉方法，且富含氫超微氣泡是安全且更易於使用[50]。